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ELISA試劑盒(酶聯(lián)免疫分析測試法)實(shí)驗操作中常見(jiàn)問(wèn)題分析(三)

時(shí)間: 2024-05-20  

四、顯色和比色

   TMB 經(jīng)HRP 作用后,約40 分鐘顯色達ding峰,隨即逐漸減弱,至2 小時(shí)后即可wan全消退至無(wú)色。TMB 的終止液有多種,疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉(SDS)等酶抑制劑均可使反應終止。這類(lèi)終止劑尚能使藍色維持較長(cháng)時(shí)間(12-24 小時(shí))不褪,是目視判斷的良好終止劑。此外,各類(lèi)酸性終止液則會(huì )使藍色轉變成黃色,此時(shí)可用特定的波長(cháng)(450nm)測讀吸光值。酶標比色儀簡(jiǎn)稱(chēng)酶標儀,通常指專(zhuān)用于測讀ELISA 結果吸光度的光度計。酶標儀的主要性能指標有:測讀速度、讀數的準確性、重復性、精確度和可測范圍、線(xiàn)性等等。優(yōu)良的酶標儀的讀數一般可精確到0.001,準確性為±1%,重復性達0.5%。酶標儀不應安置在陽(yáng)光或強光照射下,操作時(shí)室溫宜在15 -30℃ ,使用前先預熱儀器 15-30 分鐘,測讀結果更穩定。

   測讀 A 值時(shí),要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,如OPD用492nm 波長(cháng)。有的酶標儀可用雙波長(cháng)式測讀,即每孔先后測讀兩次,兩次在zui適波長(cháng)(W1),第二次在不敏感波長(cháng)(W2),兩次測定間不 移動(dòng)ELISA 板的位置,zui終測得的A 值為兩者之差(W1-W2)。雙波長(cháng)式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。 肉眼判斷結果時(shí),顯色淺不易觀(guān)察,影響結果的準確性,必須使用酶標儀檢測,以保結果一致性。



五、HooK效應影響

   隨著(zhù)ELISA一步法的應用,一些標本中抗原含量過(guò)高,產(chǎn)生HooK效應。影響檢測結果,采用同步稀釋測定或使用線(xiàn)性范圍高的兩對半定量法可以減HooK反應的發(fā)生。

六、干擾物質(zhì)的影響

   有人認為大約 40%的人血清標本中含有非特異性干擾物質(zhì),可以不同程度影響檢測結果;常見(jiàn)的干擾物質(zhì)有:類(lèi)風(fēng)濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig (s)抗體、交叉反應物質(zhì)和其它物質(zhì)等。如RF因子可與標記二抗的FC段法結合造成假陽(yáng)性,補體從C1q活化,使一抗和酶標二抗的抗體分子發(fā)生變構,Fc的C1q分子結合點(diǎn)暴露出來(lái),則補體C1q可將二者連接起來(lái)造成假陽(yáng)性,采用56℃30分鐘滅活補體可降低假陽(yáng)性率,高濃度的AFP(如孕婦),在儲存過(guò)程中可能形成二聚體會(huì )導致本底過(guò)深影響檢測結果。

七、藥物的影響

   高效價(jià)的乙肝免疫球蛋白會(huì )與 HBsAg形成復合物,影響HBsAg的檢出,所以一些HBsAg陽(yáng)性患者注射乙肝免疫球蛋白后,HBsAg檢測會(huì )呈陰性反應,導致乙肝兩對半少見(jiàn)模式的出現,如我們常遇到乙肝大三陽(yáng)的孕婦,為阻斷乙肝母嬰垂直傳播時(shí),在孕第8、9、10月常規注射200mg乙肝免疫球蛋白,不僅影響孕婦HBsAg的檢出;而且其所生產(chǎn)的生新兒也常出現HBsAg陰性,HBeAg 陽(yáng)性和HBcAb陽(yáng)性等少見(jiàn)模式、可能是乙肝免疫球蛋白屬I(mǎi)gG抗體能通過(guò)胎盤(pán)進(jìn)入胎兒體內與胎兒血液中的HBsAg結合形成復合物;則新生兒HBsAg檢測呈陰性;用0.5M的鹽酸處理標本1小時(shí)可提高出率。 為預防乙肝,部分 HBsAg陰性人群在接種乙肝疫苗后的1—2周內,血清中可檢出HBsAg成份,形成一過(guò)性HBsAg陽(yáng)性,這可能是乙肝疫苗主要成分是HBsAg.,有方法能夠把它檢出;如電化學(xué)發(fā)光法,建議接種乙肝疫苗后1個(gè)月內不應作HBsAg檢測。

八、抗原自身因素

   融合蛋白對基因工程抗原特異性的影響。以丙肝診斷 試劑 盒為例為例,因為包被的基因工程抗原為融合蛋白,包含了來(lái)自表達載體的一些序列可以與血清中抗大腸桿菌的因子發(fā)生反應而產(chǎn)生了可疑標本。少數 HBV感染后外周血中不含HbsAg。HBV感染后絕大多數感染者外周血中可出現HBsAg, 含量在5ng~600μg/ml之間。據文獻報道,到目前為止在獻血員中所發(fā)現的HBsAg 攜帶者zui低含量為0.2 ng/ml。含量高者可達2000μg/ml以上。但有少部分HBV感染者血清HBsAg測定為陰性,如暴發(fā)性乙型肝炎、HBV的S基因發(fā)生變異等。急性重癥乙型肝炎,肝細胞中以合成HBcAg為主,很少或不合成HBsAg,從而使外周血中無(wú)HBsAg。HBV的前S/S基因編碼HBsAg,構成病毒外膜,根據所帶亞型決定簇的不同分為adw、adr、ayw和ayr。


   a決定簇具有很高的免疫原性,在HBV的自然感染或注射HBsAg 疫苗可引起抗HBs應答。如S基因145密碼子變異使得其原來(lái)的甘氨酸被精氨酸替代時(shí),可致a決定簇的抗原性發(fā)生改變,使機體產(chǎn)生的抗體對變異株無(wú)作用,且可引起HBV感染患者血清中同時(shí)出現HBsAg和抗HBs。同時(shí)乙肝疫苗接種也不能有效預防此類(lèi)變異病毒的感染。乙型肝炎病毒S基因的變異有自然變異和逃避免疫變異,變異可發(fā)生在多個(gè)部位,而且幾處突變可同時(shí)存在,這些變異有助于病毒攜帶狀態(tài)的持續存在。近來(lái),有研究表明,前S1區丟失突變(氨基酸58~118)是引起HBsAg陰性的HBV感染的重要原因,S啟動(dòng)子位于前S1,是合成HBsAg的調節元件,前S1的丟失突變則會(huì )影響S啟動(dòng)子的功能,進(jìn)而影響HBsAg的合成。



總之,優(yōu)質(zhì)的 試劑,良好狀態(tài)的儀器,排除各種影響因素的干擾和正確的操作是保證ELISA 檢測結果準確可靠的必要條件。

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